La ciencia moderna de los péptidos se basa en la capacidad de ensamblar secuencias precisas de aminoácidos a demanda. Este capítulo explica cómo se sintetizan los péptidos, por qué la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) es el método predominante, qué problemas pueden surgir con secuencias complejas y cómo las etapas posteriores a la síntesis, como la ciclación y la liofilización, transforman una secuencia teórica en un producto de investigación útil.
2.1 Resumen histórico de la síntesis de péptidos
La síntesis temprana de péptidos se basaba en la química en fase líquida , donde los aminoácidos se acoplaban en solución mediante ciclos de protección y purificación laboriosos y de múltiples pasos. El trabajo fundamental de Fischer y, posteriormente, de Bergmann y Zervas, demostró que la selección cuidadosa de grupos protectores podía controlar la reactividad y permitir el crecimiento gradual de la cadena ( NCBI amino acid chemistry overview ).
Un avance crucial se produjo en la década de 1960 cuando Bruce Merrifield introdujo la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) , por la cual recibió el Premio Nobel de Química en 1984. En la SPPS, el péptido en crecimiento se ancla a una perla de resina insoluble, lo que agiliza considerablemente los ciclos de lavado, desprotección y acoplamiento. Este método transformó los péptidos, de curiosidades de laboratorio raras y difíciles de sintetizar, en herramientas prácticas que podían producirse a gran escala ( descripción general de la síntesis de péptidos en fase sólida ).
2.2 Síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS)
La síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) es la herramienta fundamental de la fabricación moderna de péptidos. El concepto básico es simple:
- Unir el aminoácido C-terminal de la secuencia deseada a una resina sólida.
- Proteja todos los demás grupos reactivos del aminoácido.
- Repita los ciclos de desprotección y acoplamiento para agregar un aminoácido a la vez.
- Una vez ensamblada la secuencia completa, separe el péptido de la resina y elimine los grupos protectores.
Dado que el péptido queda inmovilizado en la resina, se pueden utilizar reactivos en exceso para completar las reacciones y luego eliminarlos fácilmente mediante lavado. Los sintetizadores automatizados pueden ejecutar docenas o cientos de estos ciclos con alta reproducibilidad, por lo que la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) se utiliza para todo tipo de compuestos, desde pequeños péptidos de investigación hasta complejos candidatos farmacéuticos (JACS – Peptide Synthesis Research ).
2.2.1 Estrategias de protección
En la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS), la mayoría de los grupos reactivos se "enmascaran" temporalmente mediante grupos protectores, de modo que en cada paso solo se produce la reacción deseada. Existen dos estrategias de protección predominantes:
- Estrategia Boc : utiliza tert-butoxicarbonilo (Boc) para proteger el grupo amino; requiere un ácido fuerte (normalmente TFA) para la desprotección.
- Estrategia Fmoc : utiliza fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc); desprotegido con una base suave (piperidina), que es más compatible con muchas cadenas laterales y se ha convertido en el estándar para la mayoría de las síntesis a escala de investigación ( referencias de la metodología Fmoc a través de PubMed ).
Las cadenas laterales (por ejemplo, Lys, Asp, Glu, Ser, Tyr, Cys) están protegidas con grupos ortogonales que permanecen intactos durante los ciclos repetitivos de desprotección/acoplamiento y se eliminan solo en el paso de escisión final.
2.2.2 Tipos de resina
La elección de la resina afecta la funcionalidad del extremo C-terminal del péptido y la facilidad con que el producto puede ser escindido al final de la síntesis. Algunas resinas comunes son:
| Tipo de resina | Extremo C típico después de la escisión | Condiciones de clivaje | Usos comunes |
|---|---|---|---|
| resina Wang | Ácido carboxílico libre (-COOH) | Ácido fuerte (p. ej., TFA) con agentes secuestrantes | Péptidos de uso general con ácidos C-terminales. |
| Resina de amida Rink | amida C-terminal (-CONH 2 ) | Ácido fuerte (p. ej., TFA) con agentes secuestrantes | Péptidos en los que se desea un extremo amida neutro (común en péptidos bioactivos). |
| resina de clorotritilo | Ácido carboxílico libre con escisión suave | Ácidos más suaves (por ejemplo, HFIP en DCM) | Síntesis de fragmentos, péptidos sensibles. |
2.2.3 Reactivos de acoplamiento
Para formar cada nuevo enlace peptídico, el grupo carboxilo del aminoácido entrante debe activarse para que reaccione eficientemente con el grupo amino libre del péptido unido a la resina. Los reactivos de acoplamiento comunes incluyen:
- DIC o DCC con aditivos como HOBt u Oxyma Pure.
- HBTU, HATU y reactivos de uronio/guanidinio relacionados.
- Nuevos reactivos de baja racemización optimizados para secuencias difíciles.
Estos reactivos forman intermediarios reactivos que generan rápidamente enlaces amida en condiciones controladas, aunque también pueden causar reacciones secundarias si no se optimizan adecuadamente ( discusión sobre cromatografía y control de calidad ).
2.3 Síntesis de péptidos en fase líquida
En la síntesis en fase líquida, cada fragmento se construye y purifica en solución antes de acoplarse al siguiente. Este método puede ser ventajoso cuando se requiere una pureza extremadamente alta para los fragmentos intermedios o cuando se producen péptidos muy cortos a escala industrial.
Sin embargo, dado que cada paso de acoplamiento suele requerir aislamiento y purificación, la síntesis en solución es más laboriosa que la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS). Por este motivo, las rutas en fase líquida se utilizan actualmente con mayor frecuencia para ensamblar fragmentos de mayor tamaño que posteriormente se unen (condensación de fragmentos) o para procesos industriales especializados donde la química se ha optimizado al máximo.
2.4 Condensación de fragmentos
A medida que aumenta la longitud del péptido, el rendimiento global disminuye debido a que cada paso de acoplamiento tiene una eficiencia inferior al 100%. Una estrategia para construir cadenas más largas consiste en sintetizar fragmentos más cortos por separado (por ejemplo, de 10 a 20 aminoácidos cada uno), purificarlos y, posteriormente, acoplarlos.
Condensación de fragmentos:
- Reduce el número de pasos de acoplamiento consecutivos en una sola cadena.
- Permite la optimización independiente de segmentos difíciles.
- Puede ayudar a gestionar los problemas de agregación durante la síntesis.
La contrapartida es que los acoplamientos fragmento-fragmento en sí mismos pueden ser complicados y pueden requerir condiciones de acoplamiento especializadas y una purificación cuidadosa.
2.5 Síntesis de péptidos en fase sólida asistida por microondas
La síntesis de péptidos en fase sólida asistida por microondas utiliza energía de microondas controlada para acelerar las etapas de acoplamiento y desprotección. La temperatura elevada, bajo condiciones cuidadosamente controladas, puede:
- Aumentar las velocidades de reacción y reducir los tiempos de ciclo.
- Mejorar la eficiencia de acoplamiento para residuos con impedimento estérico.
- Ayuda a interrumpir la agregación transitoria en la resina.
Cuando se optimiza adecuadamente, la síntesis de péptidos en fase sólida mediante microondas (SPPS) puede acortar significativamente el tiempo de síntesis de péptidos de longitud media y larga, aunque debe equilibrarse con el riesgo de reacciones secundarias a temperaturas más altas ( Nature – métodos y avances en péptidos ).
2.6 Secuencias difíciles y fallos de síntesis
No todas las secuencias peptídicas se comportan adecuadamente durante la síntesis. Algunos problemas comunes son:
- La agregación en la resina (los residuos hidrófobos o con ramificaciones β) puede provocar que la cadena en crecimiento se aglomere, impidiendo que los reactivos lleguen a los sitios reactivos.
- Racemización : bajo ciertas condiciones de acoplamiento, los centros quirales pueden invertirse, creando estereoisómeros no deseados.
- Reacciones secundarias : formación de aspartimida, oxidación de Met y Cys o reordenamientos de la cadena principal.
- Acoplamiento o desprotección incompletos : dan lugar a secuencias de eliminación e impurezas truncadas.
Los químicos de péptidos experimentados abordan las secuencias difíciles mediante:
- Cambiar los disolventes o añadir agentes caotrópicos para reducir la agregación.
- Cambiar a diferentes reactivos de acoplamiento o realizar pasos de doble acoplamiento resulta complicado.
- Reducir la temperatura o el tiempo de reacción durante las etapas sensibles.
- Utilizar dipéptidos de pseudoprolina o grupos protectores de la cadena principal para alterar la estructura temporal.
| Asunto | Causa típica | Estrategia común de mitigación |
|---|---|---|
| Baja eficiencia de acoplamiento | Impedimento estérico, agregación, activación insuficiente | Doble acoplamiento, cambio de reactivo, aumento de temperatura, modificación del disolvente. |
| Racemización | Activadores agresivos o activación prolongada | Utilizar reactivos de baja racemización, acortar el tiempo de activación, temperaturas más bajas. |
| Formación de aspartimida | Secuencias con Asp-Gly, Asp-Ser, etc. en condiciones básicas | Utilice protección alternativa para las cadenas laterales, reduzca la exposición de la base. |
| Oxidación (Met, Cys, Trp) | Exposición al aire, oxidantes fuertes, luz | Utilizar antioxidantes, trabajar en atmósfera inerte, proteger de la luz. |
2.7 Modificación post-síntesis: ciclación, PEGilación, lipidación
Una vez que el péptido lineal se ha ensamblado y separado de la resina, se pueden emplear pasos químicos adicionales para ajustar con precisión sus propiedades. Estas modificaciones post-síntesis son fundamentales tanto para las herramientas de investigación como para las terapias avanzadas basadas en péptidos ( revisión de estrategias de modificación de péptidos ).
2.7.1 Ciclación
La ciclación une el extremo N-terminal con el extremo C-terminal o cadenas laterales seleccionadas para formar un anillo. Entre sus beneficios se incluyen:
- Mayor resistencia a la degradación proteolítica.
- Flexibilidad conformacional reducida, lo que puede mejorar la especificidad de unión.
- Alteración de la solubilidad y las interacciones con la membrana.
2.7.2 PEGilación
La PEGilación consiste en la unión de cadenas de polietilenglicol (PEG) al péptido. El PEG es hidrofílico y flexible, y puede:
- Aumentan el tamaño molecular aparente y reducen la depuración renal.
- Mejora la solubilidad y reduce la agregación.
- Enmascarar los residuos cargados, alterando la distribución y los patrones de interacción.
2.7.3 Lipidación
La lipidación consiste en la unión de cadenas de ácidos grasos u otros grupos hidrófobos a residuos específicos. Esto puede:
- Promueve la unión a proteínas séricas o membranas.
- Alterar la distribución en los sistemas biológicos.
- Proporcionar un mecanismo para incorporar péptidos en liposomas o nanopartículas.
2.8 Liofilización: de solución a polvo estable
La mayoría de los péptidos utilizados en investigación se suministran como polvos liofilizados (deshidratados por congelación) . La liofilización elimina el agua a baja temperatura y al vacío, preservando mejor la estructura y la estabilidad de los péptidos que el secado convencional.
Un proceso típico de liofilización incluye:
- Congelación de la solución de péptidos, a menudo con excipientes cuidadosamente seleccionados.
- Secado primario al vacío, donde el hielo se sublima.
- Secado secundario para eliminar el agua ligada residual.
Los péptidos liofilizados correctamente presentan una mayor vida útil y pueden reconstituirse con los disolventes adecuados cuando sea necesario. En las fichas técnicas del producto se suele proporcionar información detallada sobre el almacenamiento y la reconstitución, respaldada por estudios de estabilidad mediante métodos como HPLC y espectrometría de masas ( datos estructurales de RCSB , recursos sobre métodos HPLC ).
2.9 Resumen del capítulo 2
En este capítulo, exploramos cómo los péptidos pasan de secuencias teóricas a materiales tangibles. La síntesis moderna de péptidos en fase sólida permite el ensamblaje eficiente y automatizado de cadenas de aminoácidos, mientras que la síntesis en solución y la condensación de fragmentos siguen siendo valiosas para casos específicos. Las estrategias de protección, la selección de resinas y los reactivos de acoplamiento influyen en el rendimiento y la pureza, y las secuencias complejas requieren técnicas especializadas para evitar la agregación, la racemización y las reacciones secundarias.
Las modificaciones posteriores a la síntesis, como la ciclación, la PEGilación y la lipidación, refinan aún más el comportamiento de los péptidos, y la liofilización convierte las soluciones sensibles en polvos estables aptos para su almacenamiento y distribución. En conjunto, estos métodos constituyen la base práctica de la fabricación de péptidos, preparando el terreno para el Capítulo 3, donde examinamos en detalle la purificación, la verificación analítica y el control de calidad.
